淺析慢病毒載體

慢病毒載體介紹

    慢病毒載體（ Lentiviral vector, LVs ）是在 HIV-1 病毒基礎(chǔ)上改造而成的病毒載體系統(tǒng)，它能的將目的基因（或 RNAi ）導(dǎo)入動物和人的原代細(xì)胞或細(xì)胞系。慢病毒載體基因組是正鏈 RNA ，其基因組進入細(xì)胞后，在細(xì)胞漿中被其自身攜帶的反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)為 DNA ，形成 DNA 整合前復(fù)合體，進入細(xì)胞核后， DNA 整合到細(xì)胞基因組中。整合后的 DNA 轉(zhuǎn)錄 mRNA ，回到細(xì)胞漿中，表達(dá)目的蛋白；或產(chǎn)生 RNAi 干擾。

    慢病毒載體介導(dǎo)的基因表達(dá)或 RNAi 干擾作用持續(xù)且穩(wěn)定，原因是目的基因整合到宿主細(xì)胞基因組中，并隨細(xì)胞基因組的分裂而分裂。另外，慢病毒載體能有效感染并整合到非分裂細(xì)胞中。以上特性使慢病毒載體與其它病毒載體相比，比如不整合的腺病毒載體、整合率低的腺相關(guān)病毒載體、只整合分裂細(xì)胞的傳統(tǒng)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，有鮮明的特色。大量文獻研究表明，慢病毒載體介導(dǎo)的目的基因長期表達(dá)的組織或細(xì)胞包括腦、肝臟、肌肉、視網(wǎng)膜、造血干細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等。

    慢病毒載體不表達(dá)任何 HIV-1 蛋白，免疫原性低，在注射部位無細(xì)胞免疫反應(yīng)，體液免疫反應(yīng)也較低，不影響病毒載體的第 2 次注射。

 

慢病毒載體的構(gòu)建

1. 構(gòu)建原理

   慢病毒屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科，但其基因組結(jié)構(gòu)復(fù)雜，除 gag、pol 和 env 這 3 個和單純逆轉(zhuǎn)錄病毒相似的結(jié)構(gòu)基因外，還包括 4 個輔助基因，vif、vpr、nef、vpu 和 2 個調(diào)節(jié)基因 tat 和 rev 。 HIV 21 是慢病毒中特征性的病毒，*個慢病毒載體系統(tǒng)即以此病毒為基礎(chǔ)進行構(gòu)建的。慢病毒載體的構(gòu)建原理就是將 HIV 21 基因組中的順式作用元件 （ 如包裝信號、長末端重復(fù)序列 ） 和編碼反式作用蛋白的序列進行分離。載體系統(tǒng)包括包裝成分和載體成分：包裝成分由 HIV 21 基因組去除了包裝、逆轉(zhuǎn)錄和整合所需的順式作用序列而構(gòu)建，能反式提供產(chǎn)生病毒顆粒所需的蛋白；載體成分與包裝成分互補，含有包裝、逆轉(zhuǎn)錄和整合所需的 HIV 21順式作用序列。

    同時具有異源啟動子控制下的多克隆位點及在此位點插入的目的基因。為降低兩種成分同源重組產(chǎn)生有復(fù)制能力的病毒 （RCV ） 的可能性，將包裝成分的 5 ′ LTR 換成巨細(xì)胞病毒 （CMV ） 立即早期啟動子，3 ′ LTR 換成 SV 40 polyA 位點等。將包裝成分分別構(gòu)建在兩個質(zhì)粒上，即一個表達(dá) gag 和 pol、另一個表達(dá) env 。根據(jù)這個原理，Naldini 和 Kafri 等構(gòu)建了三質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)。

2. 三質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)

    三質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)包括包裝質(zhì)粒、包膜蛋白質(zhì)粒和轉(zhuǎn)移質(zhì)粒。其中包裝質(zhì)粒在 CMV 啟動子的控制下，表達(dá) HIV 21 復(fù)制所需的全部反式激活蛋白，但不產(chǎn)生病毒包膜蛋白及輔助蛋白 vpu；包膜蛋白質(zhì)粒編碼水泡性口炎病毒 G 蛋白 （V SV 2G），應(yīng)用 VSV 2G 包膜的假構(gòu)型慢病毒載體擴大了載體的靶細(xì)胞嗜性范圍，而且增加了載體的穩(wěn)定性，允許通過高速離心對載體進行濃縮，提高了滴度； 轉(zhuǎn)移質(zhì)粒中除含有包裝、逆轉(zhuǎn)錄及整合所需的順式序列，還保留 350 bp 的 gag 和 RRE，并在其中插入目的基因或標(biāo)志基因 （ 綠色熒光蛋白 GFP） 。將載體系統(tǒng)分成三個質(zhì)粒zui大的益處是使序列重疊的機會大大減少，減少載體重組過程中產(chǎn)生 RCV 的可能性。通過三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染 293T 細(xì)胞，超速離心后病毒滴度可達(dá) 109IU /m l 。

3. 四質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)

    為了減少 HIV 21 包裝結(jié)構(gòu)的序列同源性，進一步減少重組成 RCV 的可能性，Dull 等人將輔助基因去除。但由于 gag2pol 的轉(zhuǎn)運需要 rev，因此，在上述的三質(zhì)粒系統(tǒng)的基礎(chǔ)上，構(gòu)建成四質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)，該系統(tǒng)加上含 rev 的質(zhì)粒減少了產(chǎn)生 RCV 的可能性，而且對非分裂期細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)效率無影響。

 

慢病毒載體應(yīng)用

1. 將目的基因 /RNAi 基因轉(zhuǎn)入難以轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，比如神經(jīng)元細(xì)胞、干細(xì)胞或其它原代細(xì)胞；

2. 將目的基因 /RNAi 基因轉(zhuǎn)入動物組織，以期獲得長期表達(dá)；

3. 構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)目的蛋白 /RNAi 的細(xì)胞系，再用exvivo的方法導(dǎo)入動物體內(nèi)；

4. 基因治療；

5. 轉(zhuǎn)基因動物；

6. 基因敲除；

7. 藥物研究：構(gòu)建表達(dá)受體蛋白的細(xì)胞系，研究藥物的作用；

8. 快速建立生產(chǎn)目的蛋白的細(xì)胞系，非常有前途的真核細(xì)胞表達(dá)方法。

 

    慢病毒（ Lentivirus ）載體是以 HIV-1 （人類免疫缺陷 I 型病毒）為基礎(chǔ)發(fā)展起來的基因治療載體。區(qū)別一般的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，它對分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞均具有感染能力。慢病毒載體的研究發(fā)展得很快，研究的也非常深入。該載體可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上，從而達(dá)到持久性表達(dá)。在感染能力方面可有效地感染神經(jīng)元細(xì)胞、肝細(xì)胞、心肌細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、干細(xì)胞等多種類型的細(xì)胞，從而達(dá)到良好的的基因治療效果，在美國已經(jīng)開展了臨床研究，效果非常理想，因此具有廣闊的應(yīng)用前景。