淺析質粒與載體

 

一、質粒的組成要素


a復制起始位點Ori 即控制復制起始的位點。原核生物DNA分子中只有一個復制起始點。而真核生物DNA分子有多個復制起始位點。
b 抗生素抗性基因 可以便于加以檢測，如Amp+ ,Kan+
c 多克隆位點MCS 克隆攜帶外源基因段
d P/E 啟動子/增強子
e Terms 終止信號
f 加poly（A）信號 可以起到穩(wěn)定mRNA作用


二、質粒圖譜如何讀取


*步：首先看Ori的位置，了解質粒的類型（原核/真核/穿梭質粒）
第二步：再看篩選標記，如抗性，決定使用什么篩選標記。
（1）Ampr 水解β－內酰胺環(huán)，解除氨芐的毒性。
（2）tetr 可以阻止四環(huán)素進入細胞。
（3）camr 生成氯霉素羥乙酰基衍生物，使之失去毒性。
（4）neor（kanr） 氨基糖苷磷酸轉移酶 使G418（長那霉素衍生物）失活
（5）hygr 使潮霉素β失活。
第三步：看多克隆位點（MCS）。它具有多個限制酶的單一切點。便于外源基因的插入。如果在這些位點外有外源基因的插入，會導致某種標志基因的失活，而便于篩選。決定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。
第四步：再看外源DNA插入段大小。質粒一般只能容納小于10Kb的外源DNA段。一般來說，外源DNA段越長，越難插入，越不穩(wěn)定，轉化效率越低。
第五步：是否含有表達系統(tǒng)元件，即啟動子－核糖體結合位點－克隆位點－轉錄終止信號。這是用來區(qū)別克隆載體與表達載體。克隆載體中加入一些與表達調控有關的元件即成為表達載體。選用那種載體，還是要以實驗目的為準繩。
啟動子－核糖體結合位點－克隆位點－轉錄終止信號
a 啟動子－促進DNA轉錄的DNA順序，這個DNA區(qū)域常在基因或操縱子編碼順序的上游，是DNA分子上可以與RNApol特異性結合并使之開始轉錄的部位，但啟動子本身不被轉錄。
b增強子/沉默子－為真核基因組（包括真核病毒基因組）中的一種具有增強鄰近基因轉錄過程的調控順序。其作用與增強子所在的位置或方向無關。即在所調控基因上游或下游均可發(fā)揮作用。/沉默子－負增強子，負調控序列。
c核糖體結合位點/起始密碼/SD序列（Rbs/AGU/SDs）：mRNA有核糖體
d 轉錄終止順序（終止子）/翻譯終止密碼子：結構基因的zui后一個外顯子中有一個AATAAA的保守序列，此位點down－stream有一段GT或T富豐區(qū)，這2部分共同構成poly（A）加尾信號。結構基因的zui后一個外顯子中有一個AATAAA的保守序列，此位點down－stream有一段GT或T富豐區(qū)，這2部分共同構成poly（A）加尾信號。
 


三、載體相關知識


1. 載體的概念
    載體主要有病毒和非病毒兩大類,即要把一個有用的基因（目的基因——研究或應用基因）通過基因工程手段送到生物細胞（受體細胞），需要運載工具（交通工具）攜帶外源基因進入受體細胞，這種運載工具就叫做載體（vector）。
P.S.基因工程所用的vector實際上是DNA分子，是用來攜帶目的基因段進入受體細胞的DNA


2. 載體的分類
按功能分成：

（1）克隆載體都有一個松弛的復制子，能帶動外源基因，在宿主細胞中復制擴增。它是用來克隆和擴增DNA段（基因）的載體。（所以有時實驗時擴增效率低下，要注意是不是使用的嚴謹行載體）
（2）表達載體 具有克隆載體的基本元件（ori,Ampr,Mcs等）還具有轉錄/翻譯所必需的DNA順序的載體。


按進入受體細胞類型分：

（1）原核載體 

（2）真核載體 

（3）穿梭載體（sbuttle vector）指在兩種宿主生物體內復制的載體分子，因而可以運載目的基因（穿梭往返兩種生物之間）.

3. 基因工程載體的特點：
（一）都能獨立自主的復制：載體DNA分子中有一段不影響它們擴增的非必需區(qū)域，如MCS，插在其中的外源DNA段，能被動的跟著載體一起復制/擴增，就像載體的正常成分一樣。
（二）都能便利的加以檢測：如載體的藥物抗性基因，多是抗生素抗性基因，將受體細胞放在含有該抗生素培養(yǎng)板上培養(yǎng)生長時，只有攜帶這些抗性基因的載體分子的受體細胞才能存活。
（三）都能容易進入宿主細胞中去，也易從宿主細胞中分離純化出來。


4. 載體的選擇和制備：
選擇載體主要依據構建的目的，同時要考慮載體中應有合適的限制酶切位點。如果構建的目的是要表達一個特定的基因，則要選擇合適的表達載體。
載體選擇主要考慮下述3點：
【1】構建DNA重組體的目的，克隆擴增/表達表達，選擇合適的克隆載體/表達載體。
【2】.載體的類型：
（1）克隆載體的克隆能力－據克隆片段大小（大選大，小選小）。如<10kb選質粒。
（2）表達載體據受體細胞類型－原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳類細胞表達載體。
（3）對原核表達載體應該注意3點：
①選擇合適的啟動子及相應的受體菌；
②用于表達真核蛋白質時注意克服4個困難和閱讀框錯位；
③表達天然蛋白質或融合蛋白作為相應載體的參考。
【3】載體MCS中的酶切位點數與組成方向因載體不同而異，適應目的基因與載體易于鏈接，不產生閱讀框架錯位。
選用質粒（zui常用）做載體的4點要求：
①選分子量小的質粒，即小載體（1－1.5kb）→不易損壞，在細菌里面拷貝數也多（也有大載體）；
②一般使用松弛型質粒在細菌里擴增不受約束，一般10個以上的拷貝，而嚴謹型質粒<10個。
③必需具備一個以上的酶切位點，有選擇的余地；
④必需有易檢測的標記，多是抗生素的抗性基因，不特指多位Ampr（試一試）。