胎牛血清培養血管平滑肌細胞常用的方法

 　　胎牛血清培養血管平滑肌細胞常用的方法
　　胎牛血清培養血管平滑肌細胞常用的方法有貼塊法(explant)和酶解離法(enzyme disperse)。下面一起來看下這兩種方法。
　　1、貼塊法
　　方法：動物經頸動脈放血后，在無菌操作下迅速取出胸腹主動脈段，置于含Hank's液的平皿中漂洗3次，將凝塊洗干凈后剝除外膜的纖維脂肪層，然后縱行切開血管，刮除內膜即內皮細胞迅速撕下中膜內、中層，切成約1mm寬的小條，浸泡在含血清的Hank's液中，并將撕下小組織塊種植于培養瓶壁。置于37℃恒溫箱，2h左右，取出培養瓶加入20% HyClone胎牛血清的培養液，再放回培養箱內靜止培養4天。4天后可見細胞從組織中遷移游出。
　　不同動物血管結構有差異，豬和猴較易操作，但小動物如兔、鼠因其血管小，血管壁薄等特點，使之難以分離。另外組織塊太薄，不易粘附培養基，也使細胞較難生長。為了保證培養的成功，應注意：
　　①種植組織塊的數目，如75cm2的長頸瓶組織塊不得少于30;
　?、诟鶕囵B細胞的種屬加入適量的不同血清，一般可加入牛血清，若小牛血清增殖效果差，應加胎牛血清(FBS)，通常濃度為10%～20%;
　　③培養基的選擇：常用的有DMEM(Dulbecco's modified Eagles'medium)，M199培養基。培養兔的平滑肌細胞用DMEM效果較好。
　　2、酶解離法
　　沿動脈縱軸切開后，刮除內皮細胞撕下中膜的內2/3，注意不要混入內皮細胞，將組織塊切成1-2mm2，放入加有3mg/ml膠原酶的無血清M199培養基中，37℃，0.5～1.5h。離心去上清，重復上述消化步驟，然后再離心(9000r,4min)，收集細胞，在5%～10%同種血清或HyClone胎牛血清的M199培養基中調整細胞數，然后轉入30～90mm培養皿中培養，對于兔子應加入高濃度的谷氨酰胺(0.2g/L)較佳。不同研究者在培養基、酶濃度以及消化時間等的選擇都有很大的差異。
　　綜上所述，貼塊法具有獲得平滑肌細胞純度高，量多，操作簡便的優點。但用貼塊法易使平滑肌細胞胞質內肌絲喪失，亞細胞器增加。相反，酶解離法，由于酶的作用使細胞間失去連接，細胞內肌絲含量豐富，保持收縮型狀態。培養平滑肌細胞常取材于兔、豬、鼠、猴的胸腹主動脈段。由于貼塊法和解離法處理方式不同，在細胞培養的zui初階段細胞形態和性質存在差異。隨著培養時間的延長，培養環境趨于一致，細胞特性上也趨于近似。